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domingo, 23 de diciembre de 2012

La radiación del teléfono móvil puede alterar la expresión de proteínas en la piel humana Anu Karinen , Heinävaara Sirpa , Nylund Reetta y Dariusz Leszczynski *


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Artículo de investigación   Acceso Abierto Altamente Accedido
Anu Karinen, Heinävaara Sirpa, Reetta Nylund, Dariusz LeszczynskiBMC Genomics 2008, 9 : 77 (11 de febrero de 2008)

STUK - La radiación y la Autoridad de Seguridad Nuclear, Laippatie 4, 00880 Helsinki, Finlandia
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BMC Genómica de 2008, 9 : 77  doi: 10.1186/1471-2164-9-77

La versión electrónica de este artículo es el que completa y se puede encontrar en línea en:http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9/77

Recibido:13 de noviembre 2007
Aceptado:11 de febrero 2008
Publicado:11 de febrero 2008

© 2008 Karinen et al; licenciatario BioMed Central Ltd 
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License ( http://creativecommons.org/licenses/by/2.0 ), que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Abstracto

Fondo

Anteriormente hemos demostrado que la radiación del teléfono móvil (campos electromagnéticos de radiofrecuencia modulada; RF-EMF) altera la expresión de proteínas en la línea de células endoteliales humanas. Esto no quiere decir que respuesta similar se llevará a cabo en el cuerpo humano expuesto a esta radiación. Por lo tanto, en este estudio piloto voluntario humano, utilizando la proteómica enfoque, hemos examinado si la exposición local de la piel humana a la RF-EMF se producen cambios en la expresión de la proteína en personas vivas.

Resultados

Área pequeña de la piel del antebrazo en 10 mujeres voluntarias fue expuesto a RF-EMF (tasa de absorción específica SAR = 1,3 W / kg) y biopsias se obtuvieron de áreas expuestas y no expuestas de la piel. Proteínas extraídas de biopsias se separaron usando 2-DE y los cambios de expresión de proteínas se analizaron mediante el software PDQuest. Los análisis han identificado 8 proteínas que fueron estadística y significativamente afectados (Anova y prueba de Wilcoxon). Dos de las proteínas estaban presentes en todos los 10 voluntarios. Esto sugiere que la expresión de proteínas en la piel humana podría verse afectada por la exposición a la RF-CEM. El número de proteínas afectadas fue similar al número de proteínas afectadas observados en nuestra anterior en estudios in vitro.

Conclusión

Este es el primer estudio que muestra que los cambios moleculares a nivel podría tener lugar en voluntarios humanos en respuesta a la exposición a la RF-CEM. Nuestro estudio confirma que el enfoque de la proteómica de investigación puede identificar dianas proteicas de RF-EMF en voluntarios humanos.

Fondo

Las funciones fisiológicas del cuerpo humano están regulados por corrientes eléctricas. Por lo tanto, no es sorprendente que la colocación del cuerpo humano dentro de campo electromagnético, de resistencia suficiente, puede afectar a los procesos fisiológicos. La posibilidad de inducción de los efectos biológicos y de salud de la radiación de baja energía que emiten los teléfonos móviles (radiofrecuencia modulada campos electromagnéticos: los CEM de RF-) sigue siendo un tema controvertido. A pesar de años de investigación, todavía hay discusión en curso si RF-CEM podría producir algún efecto fisiológicamente relevantes1 ]. La gran mayoría de la investigación realizada hasta ahora se ha centrado en el cáncer. Sin embargo, la RF-CEM también se sospecha como causa potencial de enfermedades tales como trastornos del sueño, dolores de cabeza o síntomas de tipo alérgico2 ].
Nosotros hemos propuesto que el cribado proteómico puede usarse para revelar dianas moleculares de RF-CEM y ayudar a comprender el posible mecanismo bioquímico de los efectos de RF-EMF inducida 3 ]. Nuestros estudios de proteómica anteriores han demostrado que los cambios en la expresión de la proteína y la actividad (fosforilación) fueron inducidos en la línea de células endoteliales humanas EA.hy926 que se expuso a RF-CEM4 - 7 ]. Estos efectos observados in vitro, sin embargo, no significa automáticamente que cambios similares se suceden en las células de los usuarios de teléfonos móviles. Por lo tanto, el presente estudio piloto se llevó a cabo para determinar si una exposición local de la piel humana a RF-CEM se induce cambios en la expresión de proteínas y si será posible encontrar común proteína (s) que responden a RF-EMF en todos los voluntarios .

Resultados

Ethical permiso para llevar a cabo este estudio se obtuvo de la Comisión de Ética del Departamento de Cirugía del Hospital de Distrito de Helsinki y Uusimaa, Finlandia. Un área pequeña de la piel de un antebrazo de 10 de mismo sexo (femenino) voluntarios (edad 27 - 65 años, con una media 51 años) fueron irradiados durante 1 hora con 900 MHz de la señal GSM en la tasa de absorción específica (SAR) de 1,3 W / kg, utilizando la configuración especialmente diseñada exposición8 ]. El teléfono móvil de seguridad límite de SAR es de 2,0 W / kg, según lo recomendado por la Comisión Internacional de Protección contra las Radiaciones No Ionizantes (ICNIRP).
Inmediatamente después de la exposición, una biopsia en sacabocados de la zona expuesta de la piel (de la muestra experimental) fue tomada por un médico. Otra biopsia por punción fue tomado de la otra, no expuesta, antebrazo (muestra simulado). En este montaje experimental cada voluntario actuó como su propio control simulado. Tanto expuestos y no expuestos muestras de piel de todos los voluntarios fueron inmediatamente congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan antes de la extracción de proteínas.
Las proteínas de todas las muestras se extrajeron usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se separó usando 2-dimensional electroforesis en gel (2-DE) con intervalo de pH gradiente de 4-7 en la primera dimensión y 9% de gel de SDS-PAGE en la segunda dimensión (GE Healthcare). Las proteínas se detectaron por tinción con plata y patrón de puntos de distribución se analizó utilizando PDQuest 7,2 software (Bio-Rad).
Hemos analizado un fragmento de proteoma: proteínas con el punto isoeléctrico (pI) 4-7 y el peso molecular <40 kDa, debido a la separación de proteínas en lugar de 2-DE en esta área era claramente distinguible (figura 1 ). En primer lugar, el uso de software PDQuest, para cada voluntario se generó un gel artificial, mediante la combinación de perfiles de expresión de proteínas de sham y las muestras expuestas. Posteriormente, todos los 10 geles artificiales se combinaron en un solo gel maestro artificial y las manchas de proteínas expresadas diferencialmente, que fueron detectadas en al menos 4 voluntarios, se analizaron estadísticamente.
uña del pulgarFigura 1. gel maestro Artificial para todos farsa y expuestas muestras de piel de los 10 voluntarios. Estadísticamente, afectados significativamente manchas de proteínas están marcados en color rojo (expresión disminuido), y de color verde (aumento de la expresión).
La proporción de expuestos y expresión simulada muestra se analizó mancha por punto, después de la transformación logarítmica, con el análisis de varianza (ANOVA). Debido al pequeño número y violaciones potenciales de los supuestos del modelo, las razones de ellos se realizó también la prueba de Wilcoxon. El análisis estadístico ha identificado 8 proteínas expresadas diferencialmente en donde el cambio en la expresión fue estadísticamente significativa entre los 579 puntos identificados proteínas (Tabla1 ). Dos de las manchas de proteínas (# 3701, # 4801) estaban presentes en todos los 10 voluntarios, mostrando así que es posible encontrar proteínas comunes, entre los voluntarios respondieron todos. El p-valores no se ajustaron para comparaciones múltiples.
Tabla 1. Lista de proteínas que estaban presentes en al menos 4 voluntarios y que la expresión se ha modificado en forma estadísticamente significativa (<0,05) como se determina por el análisis de varianza y la prueba de Wilcoxon. Ratio = expuesta muestra la expresión / simulacro expresión muestra.

Discusión

Proteómica acercarse a estudiar los efectos de la radiación del teléfono móvil en las células se ha utilizado hasta ahora sólo por dos grupos de investigación, la nuestra en Helsinki y el grupo de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China. Nuestros estudios, utilizando líneas de células endoteliales humanas han demostrado que la radiación del teléfono móvil induce cambios estadísticamente significativos en la expresión de varias decenas de proteínas6 ] y que la respuesta de la célula podría ser dependiente del proteoma7 ]. En un estudio, el grupo en China no ha encontrado diferencias estadísticamente significativas en la expresión de proteínas en células MCF-79 ]. La razón para ello podría ser excesiva del número de experimentos en células MCF-7 estudio9 ]. En nuestros estudios el análisis estadístico se basó en 10 experimentos diferentes, mientras que Zeng et al.9 ] basado su análisis en sólo tres repeticiones. Otra razón para la diferencia podría ser diferente sensibilidad de células MCF-7, en comparación con la nuestra líneas de células endoteliales y EA.hy926 EA.hy926v1. En el otro estudio de la Universidad de Zhejiang10 ] Se encontraron 4 proteínas expresadas diferencialmente en las células epiteliales de la lente, entre ellos la proteína de respuesta al estrés Hsp70.
Los resultados obtenidos, lo que sugiere efecto de la radiación del teléfono móvil en la expresión de proteínas en líneas celulares humanas, no significa automáticamente que esta exposición tendrá ningún efecto sobre la expresión de la proteína en los seres humanos. Los estudios hasta ahora realizados con voluntarios humanos se han centrado en las respuestas cognitivas a RF-CEM[2 ] y no hay información disponible sobre el proteoma, así como transcriptoma, la respuesta a la radiación del teléfono móvil en los seres humanos. Este estudio es, a nuestro entender, la primera en la que se examinó la respuesta humana a la RF-CEM en el nivel molecular. Nuestros resultados sugieren que la piel humana podría responder a RF-CEM y el perfil de cambio de expresión de proteínas. Curiosamente, cuando el ajuste de los resultados de nuestro estudio celular anterior6] utilizando el tamaño del proteoma analizados en el presente estudio (pI 4-7; <40 kDa) el número de las proteínas estadísticamente significativamente afectados parece ser similar en este y en anteriores6 ] Estudio, 8 puntos y los puntos 9, respectivamente. El número de manchas de proteínas expresadas diferencialmente en ambos estudios es inferior al número de falsos positivos esperados. Sin embargo, como se ha demostrado experimentalmente6 ] y discutido previamente11 ] que es probable que algunas de las proteínas será de hecho, los positivos verdaderos. Sin embargo, sin ensayos adicionales, no es posible predecir si estos cambios tendrán impacto en la fisiología de la piel.
Por último, nuestro estudio confirma que el propuesto por la proteómica nos acercamos 3 ] se puede identificar dianas proteicas de RF-EMF. Este enfoque de la investigación CEM ha sido posteriormente aceptada por los científicos EMF12 , 13 ] y se ha incluido en el orden del día Mundial de la Salud 2006 la Organización de Investigación14 ]. Sin embargo, el estudio nuevo y más grande es una necesidad urgente de fortalecer nuestras observaciones experimentales y determinar qué impacto exposición teléfono móvil podría tener en los tejidos humanos.

Conclusión

▪ radiación del teléfono móvil puede alterar la expresión de proteínas en la piel humana.
▪ importancia fisiológica de este cambio no se conoce y requiere mayor estudio.
▪ Mayor estudio en voluntarios humanos serán necesarios para confirmar los resultados de este estudio piloto.
▪ La proteómica es cribado método válido para la búsqueda de dianas moleculares de la radiación del teléfono móvil. Sin este enfoque de la identificación de las proteínas que responden a la radiación del teléfono móvil no sería razonablemente posible.

Métodos

Cuestiones éticas

Ethical permiso para llevar a cabo este estudio se obtuvo de acuerdo con la Declaración de Helsinki, del Comité de Ética del Departamento de Cirugía del Hospital de Distrito de Helsinki y Uusimaa, Finlandia (Decisión N º 127/2005 emitido el 23 de noviembre de 2005). A cada voluntario se le informó en detalle sobre todos los procedimientos experimentales y cada uno de ellos ha firmado el formulario de consentimiento informado (en finés).

La exposición de voluntarios a la radiación del teléfono móvil

Los voluntarios fueron expuestos a la radiación de 900 MHz teléfono móvil GSM en un montaje experimental descrito en detalle en otra parte 8 ]. La fuente de irradiación fue de un dipolo alimentado de media onda con un ordenador controlado teléfono GSM. La tasa de absorción específica (SAR) inducida en la piel fue de 1,3 W / kg lo que está por debajo de las pautas de seguridad ICNIRP (2,0 W / kg). Durante la exposición pequeña zona de las antebrazo derecho se irradió durante una hora. El otro, no irradiado antebrazo se utilizó como control simulado.Inmediatamente después de la exposición a la piel perforadas se tomaron biopsias de la piel expuestas y no expuestas para el análisis de proteínas.

La extracción de proteínas a partir de biopsias de piel

Piel biopsias de perforación, que consisten tanto en la dermis y epidermis, pero sin el tejido adiposo subyacente, se congelaron inmediatamente después de la cosecha en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. El aislamiento y la separación de proteínas se realizaron en el modo ciego. Las proteínas fueron aisladas a partir de piel congeladas utilizando TRIzol ® protocolo reactivo como se describe por el fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) con unas pocas modificaciones. En pocas palabras, la piel picada perforadas biopsias se sumergieron en 0,5 ml de helado de reactivo TRIzol y homogeneizada en hielo con 70 golpes de la mano del mortero en Duall un triturador de tejidos ml (Kimble Chase y Ciencias de la Vida Research Products, Vineland, NJ, EE.UU.) . Después de la separación de fases de reactivo TRIzol, la fase orgánica que contiene el ADN y las proteínas se recogió. El ADN se precipitó después con etanol y las proteínas se aislaron a partir del sobrenadante de fenol-etanol. Las proteínas se precipitaron por alcohol isopropílico y un sedimento a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C. La proteína de sedimento se lavó 3 veces con 0,3 M solución de hidrocloruro de guanidina en 95% de etanol y una vez con etanol al 99,5%. Durante los gránulos de extracción se trituraron con pellet mano de mortero con el fin de mejorar la solubilidad de las proteínas. Después de cada etapa de lavado, las proteínas se centrifugaron 7500 × g durante 5 min a 4 ° C. La proteína de pellets de aire seco se disolvió en 2-DE tampón de rehidratación que contiene 9 M urea, 2% (w / v) de CHAPS, 0,5% (v / v) pH tampón IPG 4-7 y 5 mg / ml de DTT (añadido como fresco). La concentración de proteína de la muestra se midió utilizando el método de Bradford. Las muestras se almacenaron a -80 ° C.

Separación de proteínas con 2-DE

Las proteínas fueron separadas por la norma 2-DE. Brevemente, la primera dimensión se realizó en IPGphor ™ (GE Healthcare, Reino Unido) enfoque isoeléctrico (IEF) aparatos. Lineal, 24 cm de largo, pH 4-7 Immobiline DryStrip ™ geles (IPG-strips, GE Healthcare, Reino Unido) se rehidrataron en los soportes de tira durante 4 horas en 0,45 ml de tampón de rehidratación que contiene 9 M urea, 2% (w / v) CHAPS, 0,5% (v / v) de tampón IPG pH 4-7, 1,2% (v / v) DeStreak ™ reactivo, una traza de azul de bromofenol g y 150 de la cantidad total de proteína. IEF se lleva a cabo a 20 º C usando los siguientes paso y retención valores: 50 V, 8 h; 100 V, 1 h; 500 V, 1 h; 1000 V, 1 h; 2000 V, 1 h; 8000 V , hasta que se logró 95000 Vh. Entonces, las tiras de IPG se incubaron a temperatura ambiente en tampón de equilibrado (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 6 M urea, 30% (v / v) de glicerol, 2% (w / v) SDS, una traza de bromofenol azul, y 10 mg / DTT ml) durante 15 min y durante otros 15 minutos en el mismo tampón que contenía 25 mg / ml de yodoacetamida en lugar de DTT. La separación dimensión segunda-se realizó usando 9% geles SDS-PAGE. La electroforesis se llevó a cabo a 10 ° C usando una unidad de electroforesis Ettan ™ DALTsix (GE Healtcare) a una potencia constante de 3,5 W / gel durante 0,5 h y luego 13 W / gel hasta que el frente de colorante alcanzó el fondo del gel (alrededor 4 h). Los geles se tiñeron con plata listos para visualizar puntos de la proteína. Geles teñidos fueron escaneadas en la computadora usando GS-710 calibrada imágenes densitómetro (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los geles fueron analizados mediante el software PDQuest 7,2 (Bio-Rad).

Abreviaturas

CHAPS, 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanesulfonato; 2-DE, 2-dimensional electroforesis; TDT, ditiotreitol; EA.hy926, la línea de células endoteliales humanas; ICNIRP, Comisión Internacional de Protección contra las Radiaciones No Ionizantes; IEF, enfoque isoeléctrico; IPG, gradiente de pH inmovilizado; MCF-7, adenocarcinoma de mama humano línea celular; pI, punto isoeléctrico; RF-CEM, campo de radiofrecuencia electromagnética modulada; tasa de SAR, la absorción específica; SDS, dodecil sulfato de sodio; SDS-PAGE , sodio poliacrilamida con dodecil sulfato de electroforesis en gel; Tris-HCl, Tris (hidroximetil) aminometano;

Autores de las contribuciones

AK ejecutado los experimentos de proteómica y realizó el análisis de los datos de la proteómica.RN ayudó en el diseño del estudio, participó en la escritura de subvención la financiación del estudio, con la asistencia en el análisis de datos proteómicos. SH realizó el análisis estadístico de los datos. DL concebido y diseñado el estudio, obtenido subvención la financiación del estudio, ejecución coordinada y análisis de los resultados y escribió el manuscrito proyecto. Todos los autores participaron en la redacción de la versión final del manuscrito, lo leyó y lo aprobó.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. J. Halttunen (Hospital Central de la Universidad de Helsinki) para la toma de biopsias de piel. El financiamiento fue proporcionado por Tekes - Agencia finlandesa de financiación de tecnología e innovación (HERMO proyecto) y por STUK-Radiación y la Autoridad de Seguridad Nuclear.

Referencias

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    Fuente: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9/77

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